(一)病原学诊断

1.病料的采集和处理： 发病初期可采取病猪的血液，后期采取病猪的尿液，在整个发病过程中都可采取肾脏、肾上腺、肝脏等组织。血液可由静脉采取3～5毫升，加入1/10量的10%枸橼酸钠或1%草酸钠溶液抗凝剂抗凝。尿液取5～10毫升，肾脏及肝脏组织用灭菌生理盐水制成1：5或1：10悬液。血或尿液经1 500转/分离心5分钟，取上清液再以3 000～4 000转/分离心1～2小时进行集菌，然后取沉淀物涂片染色镜检。脏器悬液以1500转/分离心取上清液，再用3 000转/分离心0.5～1小时，取沉淀物涂片染色镜检。

2. 细菌学检验：

(1) 暗视野显微镜检查。钩取上述制备的样品，置于载玻片上并覆以盖玻片，在暗视野显微镜下直接检查活体钩端螺旋体，先低倍 (120倍)，后用高倍 (400倍) 检菌。钩端螺旋体呈细长弯曲，可活泼地进行旋转及伸缩屈曲地自由运动，其螺旋弯曲极为紧密，暗视野中模糊不清，常似小珠链样。钩端螺旋体的一端或两端弯转如钩，且由于旋转式摆动而可弯绕呈 “8” 字形、“丁” 字形或网球拍状，菌体常呈C、S、O等形状，这种弯曲可在运动中随时迅速消失。钩端螺旋体染色呈革兰染色阴性，用姬姆萨染色液染成淡红色，以染色液浸泡过夜效果最好。也可用方登纳氏镀银染色法，钩端螺旋体呈黑色，背景为棕色。

(2) 动物接种试验常用幼龄豚鼠、白鼠和仔兔。以幼龄豚鼠和幼龄白鼠最敏感，14～18日龄仔兔次之。将被检动物血液、尿液或肝、肾组织悬液接种体重150～200克的幼龄豚鼠，腹腔或皮下注射1～3毫升。试验动物在接种前观察2～3天，证明健康方可接种。接种后每日测温观察2次，潜伏期一般为3～5天，若材料中的病原毒力弱时，动物常表现一过性热反应症状而很快恢复; 若毒力强时，常于接种后3～5天致动物发病，表现高热黄疸、食欲减少、消瘦等典型症状，并经数日体温下降后迅速死亡。最明显的病变为广泛的黄疸和出血，肺有许多出血斑点，把肺拉开，形成所谓 “蝴蝶斑”。此时肾和肝有大量菌体，易于培养。但要注意，只有部分血清型对这些实验动物引起规律性的症状和死亡，还有许多血清型的钩端螺旋体感染后症状不明显。当体温上升时，要采血培养; 若体温不上升，接种后3～5天也要采血培养，且每隔2天培养1次。一直观察至2～3周，最后采血致死，血清留做血清学检查，肝、肾做菌体检查，分离培养，并以同一种动物继续盲目传代接种3代，继续检查仍为阴性者才能定为阴性而停止。

(二)血清学诊断 血清学试验是诊断钩端螺旋体病应用最广泛的方法，并且显微凝集试验 (MAT) 已定为标准的血清学试验，所需最少抗原量应包含这个特定国家发现的所有血清群的各个代表性菌株，加上其他地方随带的菌株。其他血清学试验也有用于猪的报道，有凝集溶解试验、补体结合试验、酶联免疫吸附试验等，但这些试验还没有被广泛应用。

显微凝集试验是猪群检测应用的基本试验方法，对至少10头猪或猪群更多的猪进行检测，以便获得有效的数据。当大多数受检动物的抗体效价达1：1000或更高时，要了解急性钩端螺旋体病和波摩那型流产的病史，增加样品体积和不同畜群的样品数量可以明显提高流行病学信息、临床疾病调查、免疫接种需要的评估和公共卫生检测的水平。当检测动物个体时，诊断急性感染显微凝集试验是非常有用的。高的抗体效价是急性期和恢复期血清样本的特征。胎儿血清中存在抗体是钩端螺旋体性流产的特征。

(1) 塑料板法。

A. 材料准备： 聚苯乙烯塑料板 (带有0.25毫升小孔)，陶瓷试验板 (混合稀释用)，自动稀释器 (25微升、50微升、100微升单道和多道加样器)，塑料滴管 (口径以1滴0.025毫升为度)，活菌抗原 (将生长良好的钩端螺旋体菌种接种在合适的液体培养基中置30培养。菌种接种量为10%。一般培养3～6天即可达到合适的菌数，此即可作为抗原); 稀释液用pH值为7.2的磷酸盐缓冲溶液 (PBS)。

B.操作程序： 用自动稀释器将血清样品用磷酸盐缓冲液在塑料板上分别作1：15、1：45、1：150、1：450、1：1500稀释。全部血清稀释后，在每个孔内加入等量活菌抗原，其最后稀释度为1：30 、1：90 、1：300、1：900、1：3000，超过1：3000滴度的血清样品可以用同样的方法依次稀释。阳性和阴性对照血清应与各组试验同时稀释。稀释完毕后，将塑料板置37℃温箱中，孵育1.75小时。

C.结果判定： 孵育后直接用显微镜6.3倍物镜、12.5倍目镜观察。凝集程度可分为#、+++、++、+，以大约50%菌体凝集为最低阳性。记录时首先观察板片底部的凝集程度，然后记录上边剩余的活动菌体。含有高滴度抗体的血清，当低倍稀释时，如1：30，可出现一种近似前带现象的凝集。这种凝集现象为紧密在一起的菌体 (溶解体) 所代替，并经常看不到活动的菌体，菌体凝成良好的疏松的蛛网状。如不细心观察这些疏松的凝集现象，可误认为阴性反应。

(2) 载玻片法，又叫显微镜凝集试验。使用活抗原的显微镜凝集试验是一种应用最广泛的血清学方法。

A.材料准备： 基本材料同塑料板法，另准备载玻片、试管等。

B. 操作程序： 血清在试管内或平板上作1：15、1：50、1：150、1：500、1：1500、1：5000、1：15000、1：50000倍稀释，稀释后的血清加入等量的抗原，其最后稀释度为1：30、1：100、1：300、1：1000、1：3000、1：10000、1：30000、1：100000。用蜡笔将载玻片画成合适的小方格，再用铂金耳蘸取一铂耳稀释的血清置载玻片上，然后加一铂金耳的抗原混合。一个载玻片可放6点血清抗原混合物，每块玻片都放置在弯曲的玻棒上或放在含有潮湿滤纸的平皿中以防干燥，玻片下垫以火柴梗，盖上平皿盖并放置室温30分钟。为了观察结果，使用暗视集光器，10倍物镜和10倍目镜，并间断地扭动显微镜细螺旋。从试验到观察结果最少需要30分钟，除玻片干涸外，在不影响判断结果时可延长观察时间。

C.结果判定： 按照惯例为最高稀释度呈50%凝集，试验时血清必需稀释为1：100和1：1000。最高滴度必需出现50%凝集可判为阳性。必要时考虑两次采血，即病初和病后2周两次采血，在检查第2次血清时，凝集滴度比第1次血清增高10倍时即表明感染了该病。