猪繁殖与呼吸综合征 (Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的猪的一种繁殖障碍与呼吸困难的传染病。其特征为发病母猪厌食、发热，怀孕后期发生流产、死胎和木乃伊胎，幼龄仔猪发生呼吸道症状[1]。1987年在美国中西部首先发现该病，并分离到病毒，其后在北美、欧洲、亚洲等国家流行。目前该病已在全球范围内传播、蔓延[2­3]。我国郭宝清等[4]于1996年首次从暴发流产的胎儿中分离到PRRSV。国内诸多血清学检测结果表明，该病在我国许多地方已有流行[5]。河南某猪场发生临床症状疑似PRRS的传染病，用间接ELISA法检测，呈PRRS抗体阳性。从病猪肺、淋巴结病料中分离到1株疑似PRRSV，并对其进行了一系列的鉴定。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病料 采自河南某猪场疑似 PRRS发病仔猪肺脏及淋巴结。
1.1.2 细胞及血清 细胞系Marc­145、Vero、PK­15均购自中国兽药监察所；阳性血清购自中国兽药监察所；阴性血清采自无PRRS病史猪场的新生仔猪血清，经中和试验证明为阴性。
1.1.3 主要试剂及试剂盒 RNasin、dNTP、反转录Buffer、M­MLV、rTaq酶均购自宝生物(大连)工程有限公司；琼脂糖为Sigma公司产品；其他常规试剂均为分析纯；UNIQ­10柱式Trizol总RNA抽提纯化试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
1.1.4 RT­PCR引物设计 根据GenBank公布的 PRRSV美洲株ORF5核苷酸序列，参照文献[6]自行设计并由宝生物(大连)工程有限公司合成下述一对引物，引物扩增片段长度为 720bp；上游引物 P1 5 CTG GAG CCG TGC TAT CAT；下游引物 P2 5′­TCC ATT TCA TGA CAC CTG。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 生长液为含 100 mL/L新生牛血清(NCS)的 RPMI­l640培养液；维持液为含 20 mL/L NCS的 RPMI­l640培养液。Marc­145、Vero和PK­15细胞均在体积分数为5%的CO2培养箱中于37 ℃培养至单层后传代培养。
1.2.2 病料的处理 无菌采集发病仔猪的淋巴结、肺脏、脾脏等组织并剪碎，用 Hanks液研磨并制成5倍～10倍的乳悬液，反复冻融 3次后，经5 000 r/min离心 30 min，上清悬液用 0.22μm微孔滤膜过滤后，－20 ℃保存备用。
1.2.3 病毒的分离 将上述处理的病料悬液 1 mL分别接种于长成单层的Marc­145细胞、Vero细胞和PK­15细胞，37 ℃吸附 1 h，补加维持液至 8 mL，继续培养 3 d～5 d，反复冻融 3次，收获培养上清液，同时设参考毒株、正常细胞作为对照。出现典型PRRSV细胞病变时按上述方法继续传代，供进一步检测备用，连传5代未出现 CPE者判为阴性。
1.2.4 分离毒的毒价滴定(TCID50) 采用微量法按参照文献[7]进行，测定其在Marc­145上的 TCID50，结果按 Reed­Muench氏法计算。
1.2.5 病毒中和试验 采用固定病毒­稀释血清法，按参照文献[7]进行，并按 Reed­Muench氏法计算中和指数。
1.2.6 分离毒的动物回归试验将107.5TCID50/mL HN株病毒细胞培养液经口鼻途径接种 30日龄健康猪2头，3.0 mL/头，并设1头健康猪接种正常细胞培养物作为阴性对照，隔离饲养，每日测体温，并观察其采食、饮水、精神状况及其他临床表现，1周左右剖检观察其病变。然后分别采集接种猪和阴性猪的肺脏、淋巴结等组织，用作PCR检测。
1.2.7 RT­PCR鉴定
1.2.7.1 病毒基因组总 RNA的提取 按总 RNA抽提纯化试剂盒说明提取。
1.2.7.2 反转录(RT) 0.8 μL MgCl2(25 mmol/L)、4.0 μL 反转录buffer (5×)、2 μL：dNTP (10 mmol/L)、1.0 μL P1 (25 pmol/L)、1.0 μL P2 (2 5 pmol/L)、1.0 μL RNasin(40 U/μL)、9.2 μL 总 RNA，然后置于 PCR仪上 65 ℃
15 min后，加入 M­MLV(5 U/μL) 1.0 μL，最后 于42 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min结束反应。
1.2.7.3 PCR反应 1.4 μL MgCl2(25 mmol/L)、4.0 μL buffer(10×)、0.6 μL rTaq酶(5 U/μL)、10 μL模板 cDNA，置于 PCR仪中扩增。反应参数为：95℃ 5 min； 94 ℃
1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共进行 35个循环；最后72 ℃ 10 min。结束后将PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。
2 结果
2.1 病毒分离
将过滤后的病料悬液接种于 Marc­145细胞，盲传前 3代未出现CPE，至第 4代后开始出现规律性CPE，在 24 h～36 h出现约70%的CPE。病变特征为细胞折光性增强、变圆、膨大，部分细胞紧缩呈索状随后皱缩、脱落、形成大片空洞，与 PRRSV典型CPE相符。此毒株接种 Vero细胞和PK­15细胞不出现 CPE，判为阴性(图1)。
2.2 PRRSV分离株TCID50测定结果
按Reed­Muench法计算距离比得出 TCID50结果为10­6.50/0.1 mL，即 PRRSV分离株在Marc­145细胞上的增殖毒价为 107.5TCID50/mL。
2.3 中和试验结果
按 Reed­Muench法计算可知，PRRSV标准阳性血清对分离病毒株的中和效价为 1∶24，即 1∶24稀释的阳性血清可保护 50% Marc­145细胞不产生CPE。中和试验结果表明，PRRSV标准阳性血清能抑制该分离毒在 Marc­145细胞上增殖，此分离病毒是 PRRSV。
2.4 动物回归试验结果
将病毒细胞培养液经口鼻接种 30日龄健康仔猪后 2 d左右，仔猪开始出现体温升高，并出现轻度的呼吸困难、四肢末梢供氧不足、耳尖发紫等症状。1周左右将接种猪剖检未见明显的病理变化，仅见肺部边缘有少量的出血点，有时可观察到间质性肺炎。而对照猪则无异常变化。
2.5 RT­PCR扩增和鉴定结果
从分离的PRRSV分离株细胞培养物以及攻毒仔猪后所采取的肺脏、淋巴结等组织进行总RNA的提取，并用设计的针对 PRRSV美洲株 ORF5所设计的引物进行 RT­PCR反应，产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明，前两种材料均可扩增出 720 bp大小的条带，与预期结果相符(图2)。
1.DNA 标准 DL 2 000；2.病料上清悬液 RT­PCR 产物；3.接种猪组织悬液 RT­PCR 产物；4.对照猪组织悬液 RT­PCR 产物(阴性对照)
3 讨论
PRRS是1987年发现的一种新的猪病毒病。临床上病猪表现精神沉郁、发热、厌食及呼吸困难。母猪流产、死胎、不孕、假孕及产出弱仔，公猪性功能下降[1]。目前 PRRS已呈世界性分布，在我国也广泛存在。从 1996年初，我国郭宝清等首次从国内疑似PRRSV感染猪群检出 PRRSV抗体并分离出 PRRSV起，PRRS在我国的流行范围越来越广，血清阳性率也呈上升趋势，在我国的许多省、市(地区)已经分离到很多地方株。
PRRSV为动脉炎病毒科病毒，其有着严格的宿主范围，在常见的原代和传代细胞中不能生长，在体外培养中，能在猪原代肺泡巨噬细胞、CL2621、MA104系的克隆株
Marc­145生长增殖。本试验将处理后的病料悬液接种在Marc­145上连续传代后即出现明显的细胞病变，而将其接种在Vero、PK­15细胞则连续传 5代都不出现CPE，与有关文献报道相一致。
目前，PCR方法已被广泛应用于PRRS临床样品的检测，检测的目标通常是针对PRRSV基因组ORF7、ORF6或ORF1b[10]。已报道这种方法可以直接检测 PRRSV感染的病猪血清、精子、流产胎儿的病理组织及感染的肺泡巨噬细胞等。本试验根据PRRSV美洲株ORF5基因设计的一段引物，通过RT­PCR反应能特异性扩增出 PRRSV HN株的ORF5基因片段，且证明建立的RT­PCR方法完全可以检测病料中的 PRRSV。
本试验从河南某猪场疑似 PRRS发病仔猪的肺脏及淋巴结组织中分离到1株病毒，并进行了分离和鉴定。根据分离病毒株致Marc­145的特征性病变、动物回归试验、毒价滴定、中和试验以及 RT­PCR反应，初步判断所分离的病毒为 PRRSV。但有关该毒株的其他一些生物学特性尚待进一步鉴定。
