主要依靠临床表现和流行病学。发病前一周内与已确诊为H5N1感染的禽类或病人有接触史。

在此基础上还需具备H5N1的病原学-血清学依据。病原学诊断包括病毒分离、血清学诊断、病毒定型及定性、致病性(毒力)测定和基因诊断等。即从病人或死亡者分离到流感病毒，经鉴定为A(H5N1)型，或查到H5N1病毒颗粒或核酸基因分析确认为H5N1流感病毒。患者血清以H1试验或微量细胞中和试验确认H5N1抗体阳性，和(或) H5N1抗体效价恢复期比急性期升高。

另外，还需与其他形和亚型流行性感冒病毒感染鉴别，与其他非流感疾病鉴别，特别注意要和SARS (严重急性呼吸综合征)鉴别。

对禽流感的诊断，主要是以病原的分离和血清学检查为依据。病原的分离和鉴定可以从活体或尸体分离病毒，用棉拭子法常可从活体的气管和泄殖腔中分离到病毒，特别是从泄殖腔中分离到病毒的机会较多，为此可用不同大小的棉拭子擦取气管或泄殖腔，尽量使棉拭子擦到深部，并能刮取泄殖腔黏膜表面的滤泡，以获得足量的材料，然后将拭子放入灭菌的保存液(25%～50%甘油盐水、肉汤或1000U/ml青霉素和10mg/ml链霉素的细胞维持液)中。若在48h内进行试验，可将材料于4℃条件下保存。病料的采取时间很重要，一般在感染初期或发病急性期采取。如转为后期则因机体已形成足够的抗体而不易分离到病毒。病毒分离通常用鸡胚来进行。待检材料如系脏器，可用P.B.S.或肉汤培养基制成5～10倍乳剂，加抗菌素抑菌。如系泄殖腔拭子采取的材料，可将拭子放入溶液中浸渍，然后除去拭子，以2000～3000Qrpm 30min去掉沉渣，吸上清液接种9～10日龄鸡胚尿囊腔，继续孵育48～72h。如材料中含有病毒时，则接种48h鸡胚死亡，但在多数情况下初代分离时鸡胚多不死，为此需将经72h未死的鸡胚置冰箱内冻死后，收集尿囊液作第二代接种。如第二代接种的鸡胚仍不死亡，即可判定分离病毒为阴性。也有的实验室，用第三代接种鸡胚的结果作为判定依据。如接种的鸡胚死亡，其尿囊液对红细胞有凝集作用，可用已知的鸡新城疫阳性血清作血凝抑制试验，确定是否为新城疫病毒。只有排除新城疫病毒后，才能进一步用流感的阳性血清作琼脂扩散试验，进行流感病毒的初步鉴定。出现阳性结果时方能确保为A型流感病毒。如需进行亚型鉴定，可送专门实验室进行检查。I.血清学检查是诊断流感的重要的特异性方法。常用的有琼脂扩散试验、血凝抑制试验和神经氨酸酶抑制试验等。琼脂扩散试验用于流感病毒型的检查，是以病毒的核蛋白抗原检查血清中的抗体，故不受病毒亚型的限制，多个亚型毒株抗体均可对抗原发生阳性反应。血凝抑制试验和神经氨酸酶抑制试验，是用病毒的表面抗原(HA和NA)检查流感病毒的亚型。在实践中，由于病毒表面抗原的不稳定性，抗原成分易于发生变化，所以同一亚型的毒株，其抗原性往往并不一致，有的毒株抗原性可发生漂移。因此在检查时应注意，如某一亚型毒株的表面的H抗原为H5，在某些条件下，其中部分成分可能发生变化，变化了的部分可能和H2或H3的成分相同，因此在原毒株的H5抗原成分中就含有H2或H3特异性抗体，所以在检查时，这种血清除可对H5抗原发生阳性反应外，也可对H2或H3发生阳性反应。在禽类血清中，有些常有干扰血凝试验的非特异性抑制物质。对这些物质，可用高碘酸钾或受体破坏酶(receptor destroying enzyme，RDE)加以处理。但在实际工作中，对每份血清进行处理是很难办到的，同时在处理血清时也会降低特异性抗体水平。因此一些国家都根据自己的试验结果，规定血凝抑制试验的标准。用血凝抑制试验检查时，在采集发病期及发病2～3周的血清作对比检查，测其抗体水平，根据抗体效价的变动情况进行判定。