三、常见猪病的实验室诊断与监测

(一)猪瘟抗体检测

进行猪瘟抗体水平检测的试验主要是间接血凝试验。

1.试验原理：抗原与其对应的抗体相遇，在一定条件下会形成抗原抗体复合物，但这种复合物的分子团很小，肉眼看不见。若将抗原吸附(致敏)在经过特殊处理的红细胞表面，只需少量抗原就能大大提高抗原和抗体的反应灵敏性。这种经过猪瘟抗原致敏的红细胞与猪瘟抗体相遇，红细胞便出现清晰可见的凝集现象。

2.试验器材与试剂：96孔1100～1200V型医用血凝板;0～100微升可调微量移液器;塑料嘴;猪瘟间接血凝抗原(诊断液)，每瓶5毫升，可检测血清25～30头份;阴、阳性对照血清，每瓶各2毫升;样品稀释液每瓶10毫升;待检血清每份0.2～0.5毫升(56 ℃水浴灭活30分钟)。

3.操作步骤：

(1)加稀释液：在血凝板上1～6排的各1～9孔;第7排的1～3孔，第5孔;第8排的1～12孔各加稀释液50微升。

(2)稀释待检血清：取1号待检血清50微升加入第1排第1孔，并将塑料嘴插入孔底，右手拇指轻压弹簧2～3次混匀(避免产生过多的气泡)，从该孔取出50微升移入第2孔，混匀后取出50微升移入第3孔，直至第9孔混匀后取出50微升丢弃。此时第1排1～9孔待检血清的稀释度(稀释倍数)依次为1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512。各孔的血清倍数可表示为1∶2n。取2号待检血清加入第2排第1孔，同样按上法稀释;取3号待检血清加入第3排第1孔，直到第6排。

注意：每取1份血清时，必须更换塑料嘴1个。

(3)稀释阴性对照血清：在血凝板的第7排第1孔加阴性血清50微升，对倍稀释至第3孔混匀后丢弃50微升。此时阴性血清的稀释倍数依次为1∶2、1∶4、1∶8。第5孔为稀释液对照。

(4)稀释阳性对照血清：在血凝板的第8排第1孔加阳性血清50微升，对倍稀释至第12孔，混匀后从该孔取出50微升丢弃。此时阴性血清的稀释倍数依次为1∶2～1∶4 096。

(5)加血凝抗原：被检血清各孔、阴性对照血清各孔、阳性对照各孔、稀释液对照孔均各加血凝抗原(充分摇匀，瓶底应无红细胞沉淀)25微升。

(6)振荡混匀：将血凝板置于微量振荡器上振荡1～2分钟，如无振荡器用手轻摇匀亦可，然后将血凝板放在白纸上观察各孔红细胞是否混匀，不出现红细胞沉淀为合格。盖玻板，室温下或37 ℃下静置1.5～2小时判定结果，也可延至第2天判定。

4.判定标准：“-”表示红细胞100%沉于孔底，完全不凝集(红细胞全部沉入孔底形成边缘整齐的小圆点)。

“+”表示约有25%的红细胞发生凝集(红细胞大部分沉于孔底，边缘稍有少量红细胞悬浮)。

“++”表示50%红细胞出现凝集(少量红细胞沉入孔底，大部分红细胞悬浮于孔内)。

“+++”表示75%红细胞凝集。

“++++”表示90%～100%红细胞凝集。

5.结果判定：移去玻板，将血凝板放在纸上，先观察阴性对照血清1∶8孔，稀释液对照孔，均应无凝集或出现“+”凝集。

阳性血清对照1∶2～1∶256各孔应出现“++～++++”凝集，为合格。

在对照孔合格的前提下，再观察待检血清各孔以呈现“++”凝集的最大稀释倍数为该份血清的抗体效价。例如1号待检血清各孔，以呈现“++～++++”凝集，第7孔呈现“++”凝集，第8孔呈现“+”凝集，第9孔无凝集，那么就可以判定该份血清的猪瘟的抗体效价为1∶128(1∶27)。

接种猪瘟疫苗的猪群免疫抗体达到1∶16(第4孔呈现“++”凝集)为免疫合格。

6.注意事项：勿用900或1300血凝板，以免误判;污染严重或溶血严重的血清样品不宜检测;如为冻干诊断液，检测前必须加稀释液浸泡7～10天方可使用，否则易发生自凝现象;用过的血凝板应及时冲洗干净，勿用毛刷或其他硬物刷洗板孔，以免影响孔内光洁度;使用血凝抗原时，必须充分摇匀，瓶底应无红细胞沉积;液体血凝抗原4～8 ℃贮存有效期4个月，可直接使用，冻干血凝抗原4～8 ℃贮存有效期3年;如来不及判定结果或静置2小时结果不清晰，也可放置第二天判定;每次检测，均需设阴性、阳性血清和稀释液对照;稀释不同的试剂要素时，必须更换塑料嘴;血凝板和塑料嘴洗净后，自然干燥，可重复使用。有时会出现“前滞”现象，即第1至第2孔红细胞沉淀，而在第3至第4孔又出现凝集，这是由于抗原抗体比例失调所致，不影响结果的判定。

(二)口蹄疫抗体检测

用于口蹄疫抗体水平检测的试验也是间接血凝试验。

该试验是以口蹄疫O、A、C、Asia-Ⅰ型病毒的细胞培养物经PEG浓缩，蔗糖密度梯度超离后纯化的病毒抗原分别致敏戊二醛鞣酸处理的绵羊红细胞而制成的血凝抗原，用于快速检测动物血清中的口蹄疫特异抗体水平。该法简易、快速、特异、直观，是当前检测抗体的实用方法。根据试验目的可分为用于鉴别诊断和用于监测疫苗接种动物的抗体水平的检测方法。

检验方法和结果判定同猪瘟抗体检测。

经实验室测定，口蹄疫O型灭活疫苗的免疫猪群血清中O型抗体效价达到1∶128及其以上时，猪群可耐受20个O型强毒发病量的人工感染。

(三)猪伪狂犬病鉴别诊断

用于猪伪狂犬病鉴别诊断的试验方法为阻断ELISA方法。

1.原理：免疫效果很好的伪狂犬疫苗很多都是gE基因缺失疫苗。免疫gE基因缺失疫苗的猪可以产生抗伪狂犬病毒的抗体，猪伪狂犬gE基因抗体诊断试剂盒可以直接诊断猪血清中的gE基因抗体。如果没有感染野毒，检测会是阴性。如果感染野毒，检测就会是阳性。此试剂盒可以检测用gE基因缺失疫苗免疫的猪是否感染伪狂犬。

2.试剂盒的组成：包被伪狂犬病毒的96孔板;阳性样品(黄色);阴性样品(蓝色);酶标抗体(红色);10倍浓缩的洗液;样品稀释液;TMB底物;终止液。

3.试剂的准备：试剂使用前必须使其达到室温。清洗液和稀释液由于盐分高可能结晶，使用前必须摇匀溶解。在37 ℃水浴条件下很快溶解，在未完全溶解前勿使用。为了避免形成结晶在重悬前先使溶液达到室温。取1份清洗液加入9份灭菌水或去离子水中，稀释好的清洗液可在4 ℃保存3天或-20 ℃保存30天。

4.操作步骤：

(1)将试剂放在室温中，并轻摇混匀。

(2)将阴、阳性血清和被检样品分别稀释1倍，各加入100微升稀释好的阳性、阴性对照及样品，并做好记录。盖上膜，在37 ℃作用60分钟。

(3)去膜，用300微升的洗液洗3遍，并在吸水纸上将平板弄干(颠倒，在纸上轻敲)。

(4)各孔中加入100微升酶标抗体，盖上膜在37 ℃反应30分钟。

(5)去膜，用洗液(300微升)洗3次，弄干。加入100微升的底物，轻摇板2秒，将平板放在黑暗中在18～25 ℃作用15分钟。

(6)加入100微升的终止液，轻敲平板混匀。用柔软的东西轻拭平板上的脏物，在450纳米下读数并记录结果。

5.结果的计算：用血清抗体平均阻断率(INH%)来说明检测的结果，以下是它的计算方式：

INH%=[(阴性对照值-样品的OD值)/(阳性对照)]×100

6.结果判定：可行的结果的条件是阴性对照值-阳性对照值>0.6，INH%对照值>60%。若试验不成立，应再操作一次。

如果被检样本的阻断率大于45%，该样本就可以被判为阳性。

如果被检样本的阻断率小于40%，该样本就可以被判为阴性。

如果被检样本的阻断率在40%～45%，该样本就可以被判为可疑。

说明：本试剂盒可以用来检测新鲜的、冷藏或冷冻的血样，血样和对照在用前要稀释1倍(加入50微升的稀释液和50微升的样品或对照)。

(四)猪蓝耳病检测

用ELISA的方法检测猪血清中的PRRSV抗体。

1.原理：利用间接ELISA的原理制成。PRRSV被包被在96孔板上。样品被加在孔中，PRRSV抗体与包被的病毒结合，没结合的物质可被洗掉，再加上酶标的抗猪抗体，洗去没结合的二抗，加上底物反应，包含PRRSV抗体的样品会显色。

2.试剂盒的组成：包被PRRSV的96孔板5块;20倍浓缩的洗液120毫升;3倍浓缩的样品稀释液100毫升;酶标抗体(红色)30毫升;阳性样品(黄色)2.2毫升;阴性样品(蓝色)2.2毫升;THB底物30毫升;终止液30毫升;封盖膜5块。

3.用前准备：

(1)样品的准备(样品要用稀释液稀释200倍)：阳性和阴性样品已经准备好了，不需要稀释。

(2)试剂的准备：试剂必须在使用前使其达到室温。

　将浓缩清洗液用灭菌水或去离子水作20倍稀释，配好的液体要在7天内用完。

　将浓缩样品稀释液用灭菌水或去离子水作3倍稀释，本液体是不能保存的，必须现配，剩余液要倒掉。

4.操作程序：

(1)将试剂放在室温，并轻摇混匀，记录好所测样品和对照在平板的位子，阴阳性对照要双份。

(2)去膜，加入50微升阴阳对照样品和稀释了200倍的所测样品，盖上膜，在37 ℃作用60分钟。

(3)去膜，用300微升的洗液洗3遍，并在吸水纸上将平板弄干(颠倒，在纸上轻敲)，在每个孔中加入50微升酶标抗体，盖上膜在37 ℃反应60分钟。

(4)去膜，用洗液(300微升)洗3次，晾干。加入50微升的底物，轻摇板2秒。将平板放在黑暗中在18～25 ℃作用10分钟。

(5)加入50毫升的终止液，轻敲平板混匀。

(6)用柔软的东西轻拭平板上的脏物，在450纳米下读数并记录结果。

5.结果的分析：本实验要在450纳米下读数，阳性对照要大于0.8，即阳性样品的读数是阴性的4倍，阳性值和阴性值之差不小于0.5。

用IRPC来说明检测的结果。IRPC=[(样品的OD值-阴性对照值)/(阳性对照值-阴性对照值)]×100

6.结果说明：