1.检查方法

(1)体况和营养检查：体况和营养是长毛兔健康与否的重要标志，也是平时饲养管理好坏及疾病过程的具体表现。以手触摸长毛兔的脊椎骨，背肉丰厚，脊椎骨不易分辨，表示健康无病;脊椎骨凸起，如算盘珠，两旁凹削，臀骨亦凸，这类兔可能患有寄生虫病，如球虫病、肝片吸虫病、枝睾吸虫病;慢性消耗疾病，如伪结核耶新氏杆菌病、结核病、慢性巴氏杆菌病、慢性波氏杆菌病等，以及腹泻病或营养不良症等。

(2)姿势检查：健康长毛兔机敏活泼，行动快捷，两耳直立，起卧、运动等都有一定姿势。如歪头可能是巴氏杆菌病，转圈可能是李氏杆菌病，病理性躺卧多见于骨折等。

(3)被毛和皮肤检查：

①被毛：健康长毛兔的被毛浓密，贴体平服，有光泽。如被毛粗刚、蓬乱、暗淡无光、污浊不洁、玷污粪便，均为不健康的表现。如被毛脱落，尤其是背部、四肢和颈部被毛呈斑块脱落，并有丘疹和大小不一的结痂，可能患有体表霉菌病。

②皮肤：健康长毛兔的皮肤富有弹性，如母兔腹部皮肤呈紫暗色或硬结，则可能患乳房炎;如腹部或背部有脓性结痂，可能患葡萄球菌病;如嘴、鼻、两耳、爪等器官周围的被毛脱落，并有鳞片状物，无毛或少毛，可能患疥螨病;公兔睾丸皮肤有糠麸样皮屑以及母兔肛门周围及外生殖器官的皮肤有结痂，可能患梅毒;全身及头部皮肤、眼睑、两耳皮肤高度肿胀则可能是黏液瘤病;口腔、下颌部和胸前皮肤坏死并有恶臭，可能患坏死杆菌病;体表淋巴结肿胀，尤其是下颌淋巴结更为明显，可能是野兔热等。

(4)眼睑检查：长毛兔双眼圆瞪明亮，有神，眼球活泼，眼睑红润，眼角干净无脓性分泌物，为健康表现。眼裂变小，眼睑沉滞，半张半闭，眼球凝视、反应迟钝或眼睑干燥，多数为急性传染病;眼睑流泪或有黏液、脓性分泌物，精神萎靡，可能患慢性巴氏杆菌病、结膜炎等。

(5)耳色检查：健康白兔耳色呈粉红色，如呈白色则表示体虚血亏;如呈红色，以手触之烫热，即为发热;如耳色青紫，耳温过低，则有重病可疑。

(6)呼吸检查：健康长毛兔每分钟呼吸50～60次，而且非常平稳。但呼吸次数的变化常与年龄和气温、运动等外在环境有密切关系。幼兔比成年兔次数多，夏季比冬季次数多，追逐运动也使呼吸次数增多。

(7)体温检查：长毛兔正常体温为38～40℃ 。在正常环境下，体温偏高或偏低为病态。体温升高多为急性传染病，如急性巴氏杆菌病、兔瘟、野兔热、李氏杆菌病等。

(8)黏膜检查：

①眼结膜：健康长毛兔结膜红润。如结膜苍白，常见于急性肝、脾大出血，或严重的消耗性疾病。结膜黄染，机体消瘦，可能是肝脏寄生虫——肝片吸虫病、球虫病等;结膜发绀，常见于热性传染病如巴氏杆菌病;结膜潮红，多为体温升高的表现。

②口腔黏膜：口腔两颊、齿龈和舌黏膜有水泡或溃疡，可能是水泡性口炎。

③外生殖器官黏膜：外生殖器官黏膜肿胀、结痂、溃疡，可能是螺旋体病;黏膜结痂、溃疡，阴道有脓性分泌物，可能为葡萄球菌所致的外生殖器炎症;黏膜无结痂等变化，但阴道有分泌物排出，可能是巴氏杆菌病、李氏杆菌病、沙门杆菌病。

(9)粪便检查：健康长毛兔的肛门干净，粪球圆而光滑，大小如豌豆，内含纤维。如粪便稀烂或稀薄，并呈黑煤焦油状或混有血液，气味恶臭，可能是魏氏梭菌性肠炎;粪便呈水样稀薄，可能是泰泽氏病;仔兔粪便湿烂成堆，并附有黏液，可能是大肠杆菌病、沙门杆菌病;仔兔粪便呈稀烂状，可能是球虫病、消化不良;若粪便干硬而细小，可能是消化不良、脱水或大量服用化学药物的结果。

(10)食欲检查：兔采食量大，表示消化机能强;如不吃或少吃，表示消化机能不全，可能已患疾病。

(11)腹围检查：腹围检查主要是检查腹部容积的大小，除妊娠增大外，一般无增大的现象。如腹围增大，触摸盲肠大且有充满水及气体之感，可能是魏氏梭菌性肠炎;腹围增大，盲肠大并有充满水样之感，可能是泰泽氏病;在触摸右侧最后肋骨和第一、二腰椎横突之下，左侧第三、四腰椎横突之下的肾脏有肿大之感，可能是肾母细胞瘤;长毛兔食欲不佳，触摸胃有大而充满食物之感，可能是毛球病(表6)。

表6 诊断长毛兔主要传染病需要采取的病料

(续表)

(续表)

2.细菌学检验

(1)细菌形态学检验：观察细菌形态通常需将细菌或含有细菌的血液、组织等制成玻片标本，经固定、染色后镜检。染色的方法可分为单染色法(如美蓝染色)、鉴别染色法(如革兰染色、抗酸染色)、特殊染色法(如芽胞染色、鞭毛染色)和血片、组织片染色法(如姬姆萨染色、瑞氏染色)等。

①细菌涂片制备和染色：取清洁无油污的载玻片一张(如有油污可用脱脂棉花蘸酒精擦净)。将铂耳用酒精灯火焰烧灼灭菌后，取1～2铂耳的无菌生理盐水或蒸馏水，放在玻片的中央(如有多种材料又用同一方法染色者，可用蜡笔将玻片划成若干小格，每格涂一种材料，一张玻片可作2～3个涂面)，再将铂耳经火焰灭菌，冷却后从固体培养基上挑取细菌少许，和玻片上水滴混匀(先在水滴边缘磨匀，再扩到整个水滴磨匀)，使其成为直径约1厘米大小的涂面。涂面要求薄而匀，细菌数量要少。若是液体培养物，则不需预先在玻片上加水，可用经火焰灭菌的铂金耳直接伸入培养管中挑取1～2铂金耳液体培养物，放在玻片上，涂成均匀薄片即可。涂片任其自然干燥。干后经火焰固定，固定的目的是杀死细菌，使菌体蛋白质凝固在玻片上，不至在染色时被水冲去，并易于着色。方法是用拇指与食指拿住玻片的一端，标本面向上，以钟摆速度通过火焰3次，以不烫手背为度。

细菌涂片通常用单染色或革兰染色法，尤以后者在细菌的鉴定上有重要意义，更为常用。美蓝染色法，涂片干燥固定后，滴骆氏美蓝于片上，使之覆盖涂面，染色2～3分钟，水洗晾干或吸干，即可镜检，染色后的菌体呈蓝色;稀释复红染色法，将涂片自然干燥固定后，滴加染色液，染色1～3分钟，水洗晾干、镜检菌体呈红色;革兰染色法，涂片干燥，经火焰固定后，滴加结晶紫染色液数滴于片上，染色3分钟，用水洗去，再加革兰碘溶液于片上，作用2分钟后，倒去碘液，连续滴加95%酒精于片上，并轻轻振动，使染液洗脱，约半分钟，再用水洗去酒精，最后加沙黄水溶液(或稀释石炭酸—品红溶液)复染半分钟，水洗吸干，镜检。

革兰染色法可将细菌分成阳性和阴性两大类，革兰阳性细菌不被酒精脱色故呈紫色，革兰阴性细菌易被酒精脱色故呈红色。

②血片和组织触片的制备和染色：血片制作，取一张边缘整齐的玻片，用一端蘸取血液少许，在另一张干净、无油污的玻片上，以45°角均匀地推成一条薄而匀的血涂面;组织触片制作，将待检尸体以无菌手续打开胸腹腔后，用经火焰灭菌的镊子夹起组织(如肝、脾、肾、淋巴结等)一端，然后用灭菌剪刀剪下一小块组织，将组织块的切面在玻片上轻压一下，使玻片上留下一个组织切面的压迹(每张玻片上可作2～3个压迹)。

姬姆萨或瑞氏染色法，血片或组织片自然干燥后，滴姬姆萨或瑞氏染液数滴于片上，以覆盖涂面为度，经1分钟，使涂片为染液中的甲醇固定;再加等量蒸馏水于片上，轻轻摇晃使之与染液混合均匀;5分钟后用水冲洗(不要直接将染液倾去，应用水将染液洗去);自然干燥或吸干后镜检。

用瑞氏法染色的组织细胞呈多色性(胞浆和胞核染成不同颜色)，菌体蓝紫色易于识别。

(2)细菌的分离与培养：

①细菌的分离培养：为了研究细菌的特性和对它进行鉴定，必须将细菌从它所在的自然基质中分离出来，获得其纯培养物。分离培养的方法视待检材料的菌数多少和所分离的细菌特征而异。常规法有平板分区划线法和斜面分离法。前者用于含菌数较多的基质，如粪便、污染的培养物等;后者用于含菌数较少的基质，如从病料中分离出病原菌。

平板分区划线法，左手斜执平板，右手执铂耳，先将铂耳在酒精灯上烧灼灭菌，冷后蘸取待检材料，在平板边缘先涂一小区，再将铂耳通过火焰灭菌，冷却后通过涂过的小区连续平行划线至约平板的1/3处，过后再将铂耳灭菌，左手转动平皿，使铂金耳通过涂过的1/3区域平行划线，最后再转动平皿并划线，使细菌更为稀疏。接种时将铂耳轻轻接触平板成30°～40°角，以腕力在平板表面以轻快的动作滑动划线，接种完毕将平皿盖好，倒置于37℃温箱内培养。通常在划线之初，因菌数太多，菌落之间距离很近不易分清，后期则菌数少，可出现分散的单个菌落，便于进一步观察和钩取。上述操作方法只适用于粪便和固体培养物等细菌数极多的待检材料。如为肝脾等病料，则在第一次涂擦后连续划线，中途铂耳不必灭菌。

斜面分离法：用镊子取一小棉球，蘸酒精少许点燃，在待检病料肝、脾、淋巴结、心脏表面微微燃灼消毒，然后用一废外科刀蘸酒精后在酒精灯上点燃消毒，冷后，在病料上刺一小口。左手斜执血琼脂斜面，右手持铂耳，在火焰上灭菌，冷后自小孔内蘸病料，随即用右手小指和手掌拔去琼脂斜面管口棉塞，并在火焰上通过灭菌，将铂耳伸入管内，在斜面上由下向上弯曲涂布，接种完毕，试管口通过火焰，塞好棉塞，烧去铂耳上的剩余病料。

从病料分离培养时亦可在鲜血平板上进行，铂金耳挑取病料后同上法在平板上划线，直至接种完毕后，烧灼铂金耳。其间不烧铂耳。

②菌落的纯培养：继待检病料的分离培养之后，常需进一步作细菌形态和染色特性的观察，作培养特性、生化反应、对小动物的致病力及血清学反应等项试验。因此，必须先从分离培养(在37℃下培养24～48小时)的平板上钩取可疑菌落，进行纯培养。

③细菌的移植：斜面移植，将菌种管和新的琼脂斜面管置于左手中，一般菌种管放在外侧，新的琼脂斜面管放在内侧，两管管口并齐，管身略向上倾斜，斜面向上，管口靠近火焰。以右手的拇指和食指、中指持铂耳在酒精灯火焰上烧灼灭菌。将新的琼脂斜面管的棉塞夹在掌心和小指之间，菌种管棉塞夹在小指和无名指之间，将两管棉塞一起拔下。然后将灭菌铂耳伸入菌种管内，挑取少许细菌后，在新的培养管内，从管底部开始以曲线划至斜面顶部，最后管口通过火焰后将棉花塞塞好，随即在火焰上烧去铂耳上剩余细菌。新培养管须用玻璃蜡笔写上菌种名、日期，置温箱内培养(注意拔棉塞时，试管放在火焰旁，不能放在火焰上面，否则棉塞易着火)。

肉汤移植同上法，挑取细菌后，插入新培养管中，将铂耳上细菌在液体上部管壁部分轻轻磨下即可，磨时不要用力过大。

从平板移植到斜面，先打开平板盖，用灭菌的铂耳挑取所需菌落移入斜面，方法同上。半固体穿刺接种法基本同斜面移植法，但挑取细菌不用铂耳而用铂针，将铂针垂直刺入培养基内，一直刺到管底，然后按原方向垂直拔出铂针即可。

④厌氧菌的培养：厌氧菌的分离方法同前所述，可用平板划线分离，也可用斜面或肉汤分离。但在培养时，必须使其处于无氧环境，细菌始能繁殖生长。

熟肉基：在制作培养基时，可将肉汤培养基分装于试管中，再加数片煮熟的肉块或肝块，然后加少量液体石蜡或固体石蜡(约0.5毫升)覆盖液面，高压蒸气灭菌。临用前，需将熟肉基水浴煮沸5分钟(以排除其中空气)，冷却后使用。接种时，先将覆盖的固体石蜡沿管壁在火焰上加温，使之与试管壁脱离，然后以铂耳挑取待接种材料从蜡块空隙处插入至肉汤处。接种完毕，仍将表面石蜡热融，使之平整地覆盖住肉汤液面，竖放在试管架上，待冷，置37℃温箱中培养。

焦性没食子酸法：焦性没食子酸在碱性溶液中能吸收大量氧气，同时由淡棕色变为深棕色。如用琼脂斜面进行培养，则可将数支接种过的试管装入一大试管或瓶中，下垫以隔板，按每100厘米3空间用焦性没食子酸1克及10%氢氧化钾或氢氧化钠10毫升的比例，先将焦性没食子酸放在大试管(或瓶)中隔板底下。然后放好保养管，最后加入氢氧化钠溶液，迅速加塞，并用胶泥或固体石蜡严密封闭管(或瓶)口，置37℃温箱中培养1～2天。

连二亚硫酸钠法：培养较多量的斜面或平板时，可放在一只玻璃干燥缸中。按每1 000毫升容积用连二亚硫酸钠(又称保险粉)4克及无水碳酸钠4克，将两种药品分别研细，临用前将两药均匀混合，放在一无盖平皿内，叠放在培养基的上层，将缸盖盖严，以凡士林严密封闭，置37℃下培养1～2天。

⑤细菌在培养基中生长特性的观察：细菌在固体培养基中，经一定温度和时间培养后便可长出肉眼可见的菌落，分散的菌落易于观察。在湿温的培养基表面，能运动的细菌自由扩散，呈膜状生长，这时若增加琼脂浓度(3%～4%)并将琼脂晾干，使表面水分蒸发则可培养到单个菌落，菌落大小以直径(毫米)表示。菌落的边缘分圆整、波浪状、锯齿状、根毛状、卷毛状等，高度分隆起、圆突、扁平、脐状、乳突状等，色彩分无色、白、黄、橙、红等，有些色素还可扩散到周围基质中。湿润度可分为湿润或干燥。质地可分为坚硬、柔软或黏稠。表面构造可分为光滑或粗糙，或者同心圆、放射性状、颗粒状结构等。透明度可分为透明、半透明、不透明。在鲜血琼脂上还须观察溶血程度，如链球菌在菌落周围呈现一圈透明的溶血区者称为β溶血，菌落周围呈现很小的半透明带绿色的溶血区者称为α溶血，菌落周围不溶血者称为γ溶血。

对斜面培养基上生长的菌苔，主要观察菌苔的厚薄、湿润程度、边缘形状、生长的好坏(分丰盛和贫瘠两种)、色彩以及有无荧光性等。

对液体培养基上细菌生长的情况，主要观察液体的混浊度、液面有无菌膜或菌环、管底有无沉淀物的数量及质地情况(用振摇试管后沉淀物是否易于摇碎和沉淀物上升时的情况来表示)。

以上特性一方面与细菌种类有关，同时也与培养基的成分、培养温度与时间及细菌是否变异等因素有关。但一定的细菌在一定的培养条件下，菌落形态基本上相对稳定，这是初步鉴别细菌的依据。

各种细菌在其新陈代谢的过程中，由于利用营养物质的能力有差异，排泄的代谢产物亦不同。据此进行生化试验以鉴定细菌的种、属。

(3)药敏试验：测定致病细菌对药物的敏感程度，有助于临诊上选用合适的药物进行治疗。在采用中草药治疗疾病时，亦可用药敏试验来测定中草药的抗菌性能。药敏试验最常用的是纸片法，所需纸片可向有关单位购买，亦可自行配制。

①纸片准备：取直径6毫米的无菌滤纸片，浸于一定浓度的抗菌药液中，一般青霉素为100单位/毫升，链霉素为2毫克/毫升，氯霉素、四环素、土霉素、金霉素等为2毫克/毫升。上述药液每毫升中可浸纸100张，1～2小时后取出纸片，干燥后备用(药效可维持1～2个月)。

②操作方法：先将从病畜分离出的细菌纯种用灭菌铂耳均匀涂布于普通琼脂平板或血平板培养基表面，再用无菌镊子将含药纸片分别贴到平板培养基表面，37℃培养18～24观察结果。

③结果判断：根据含药纸片周围有无抑菌圈及其直径大小，判断该菌对各种药物敏感的程度，供临诊用药参考。

3.病毒学检验

凡是作为病毒分离培养的被检材料都应无细菌污染，如有污染则需用滤器或超速离心或加抗生素除去细菌。无囊膜的病毒病料还可应用加氯仿除细菌的方法。采取病料应选择有代表性的组织或器官。病料如不能立即进行分离培养，应用病毒保存液或冰冻保存。

(1)样品的采集和处理：病毒的实验室诊断取决于病兔样品的采取是否适宜，因此在采取和随后处理的各个环节都要予以特别注意。样品的选择决定于病兔的疾病种类、临诊症状、既往病史和检验内容与方法。

①采取样品的种类：分离病毒的样品常从病变部位采取，如上呼吸道感染可用棉拭采取鼻液或该部位的冲洗液;皮肤黏膜疾病则在病变区刮取样品，如有水泡则取水泡液;皮肤出疹则采取痂皮或血液;有神经系统症状则取脑、脊髓液，但也可采取粪便。在败血症高温期采取血液，同时加入肝素(最后浓度5～10单位/毫升)以防血凝(柠檬酸钠因有碍于病毒的分离和培养故不宜使用);病死兔可以采取病变的器官和组织。

②采集样品的时间：最好在发病早期，即症状出现后立即采取，否则病毒会迅速减少。细胞和组织的病理变化也在早期比较典型，若拖延时间，则很易造成细菌继发感染，为诊断带来混乱。病死家兔的取样亦不宜拖延，以免细菌侵入或组织自溶而干扰病毒分离。

③样品的运送：大多数病毒的感染力受到温度、pH、湿度以及细菌污染等影响。通常温度越低对病毒感染力的影响越小，冰冻过程能使很多病毒死亡，特别是缓慢的冻结。因此，如果病料在24小时内检查，最好在4℃递送和保存。如果要保存较长时间则应在-20℃、-60℃下保存。采取的样品如果数量较少，应立即浸于保存液中。

④样品的处理：样品检查以前要尽可能将非病毒物质去掉，使之成为没有颗粒、均质、具有一定浓度的悬液。病料组织剪碎后在组织研磨器内磨细，加磷酸盐缓冲液，制成1∶10悬液，2 000～3 000转/分离心沉淀15分钟，取上清液供试验用。皮肤等不易磨细的材料则可在加砂的研钵中研细。

粪便：1克粪便和9毫升磷酸盐缓冲液置于玻瓶内，振摇1分钟，然后用10 000转/分离心20分钟。吸取上层2/3的液体备用，下层液及余物弃去。

其他被检样品：棉拭的浸泡液、水泡液等如果没有颗粒状物质就不必经特殊处理，可用2 000～3 000转/分离心沉淀，将颗粒物质去除。所有样品处理最好在4℃进行，样品液中均需加入抗生素(青霉素和链霉素各1 000单位/毫升或制霉菌素200～400单位/毫升)，而在粪便样品中，抗生素的浓度要加大10倍。抗生素加入后要在4℃下放置1～2小时才能接种。较长期保存的样品应保存在-20℃条件下。

(2)实验动物的接种：在传染病的诊断过程中，常应用各种实验动物进行试验，如分离病毒，测定对动物的感染范围，进行中和试验和保护试验以及鉴定病毒和不同毒株间的抗原关系;其他病原微生物的分离、鉴定以及免疫原性的测定;还可以通过动物继代保存病毒或培养弱毒株;测定病毒的LD50或大量繁殖病毒供制造疫苗之用。

生物学试验用的实验动物，必须健康无病，不带任何病原微生物，如能使用无特殊病原体的动物(SPF动物)更好。实验动物最好用自己繁殖的纯种，或来自专门的饲养场。不能使用来历不明或已做过其他实验的动物。除了解饲养场动物健康情况外，购入后需先行隔离饲养，以观察是否健康无病。

在进行特定的试验时，首先要选择易感性强的动物。根据实验的要求，采用不同种类和不同年龄的动物，但在同一次实验中所用的动物要求年龄和体重基本一致。在实验室中最常用的动物有小白鼠、豚鼠、仓鼠、家兔、大白鼠以及鸽、鸡、鸭等。

根据实验目的不同，动物接种可采用皮下、皮内、肌肉、腹腔、鼻内、静脉和颅腔接种，使用针头的号码须根据注射部位及动物的大小而定，动物接种前必须保定，注射部位须用碘酊消毒，有时尚需剪毛或脱毛。

(3)鸡胚培养：根据病毒的适应情况和实验要求，将病毒材料接种于鸡胚不同部位(即绒毛尿囊膜、绒尿腔、羊膜腔、卵黄囊)，封闭注射孔后继续孵育。继续孵育的温度通常为37℃。某些病毒，如流感病毒，在分离时可用较低温度(33～35℃)。

鸡胚接种后，每天照蛋2～6次，一般在24小时内死亡者弃去不用，24小时后死亡者随即取出，置4℃冰箱冷藏数小时，使血管收缩，然后打开气室，根据需要收获鸡胚液和鸡胚组织，观察病变。

除上述检验方法外，有条件时可参照有关资料进行细胞培养等检验。