病原学诊断主要指细菌与病毒等病原微生物的分离鉴定，是传染病诊断技术的基础，也是一项很基本的确诊方法。

(一)细菌分离与鉴定

1.细菌培养基：培养基是按照微生物生长要求制成的一种人工营养制品，主要作为繁殖细菌微生物、分离细菌微生物、鉴定细菌微生物、保存和研究细菌微生物以及制造生物制品等用。培养细菌必须有适于细菌生长繁殖的培养基。不同种类的细菌对营养的要求有显著的差别。要培养好细菌，首先要掌握细菌生长需要的条件，以便制备各种培养基。

制备培养基时必须注意如下事项：①培养基必须含有细菌所需的各种营养物质，如蛋白胨、碳水化合物及盐类。②培养基必须含有合适的水分，因为细菌主要靠液体以弥散和渗透等方式摄取营养。③多数致病菌对酸碱值的变化均敏感，故所用的培养基需要调整pH，通常pH值为7.2～7.6，即适合多数细菌的生长。测pH值须在冷后测定，因培养基所含成分不同，在冷或热时测定pH值相差较大。④制造及装培养基的容器不应含有抑制细菌生长繁殖的物质，制造培养基的容器最好用搪瓷锅和铝锅，不用铜锅与铁锅。⑤制造培养基所用化学药品，均需化学纯以上，且各种成分要准确准量。⑥制造的培养基应均质透明。⑦培养基必须彻底灭菌，且作无菌检验合格。

随着微生物学的发展，培养基的种类与日俱增。同一种类的培养基，因原料品种的不同而有质量上的差异。因此选择用于特殊要求的合适培养基，需要有相当丰富的工作经验。为了保证工作质量，节约制备大量品种培养基的时间，目前通常采用现成的各种干粉培养基成品，用蒸馏水配制而成，此种培养基使用方便，可直接应用进行各种培养基的制备。

(1)普通培养基：①营养琼脂：取营养琼脂粉45克，加入1 000毫升蒸馏水中，加热煮沸溶解，121 ℃高压灭菌15分钟，冷却至50 ℃左右分装试管、摆成斜面或倾注于平皿制成。置37 ℃培养箱过夜，有污染者废弃，无菌者置冰箱备用。一般细菌生长的分离、纯培养、观察菌落性状及保存菌种用，为特殊培养基的基础。②鲜血琼脂：以无菌手术采取健康动物(通常是绵羊或家兔)血液，加到盛5%柠檬酸钠溶液的容器中(血与抗凝剂之比为9∶1)，混匀;或加到盛有灭菌玻璃珠的容器里，反复摇动多次制成脱纤血，制备成无菌鲜血，置冰箱中备用。将灭菌后的营养琼脂冷却至45～50 ℃，按5%～10%加入无菌鲜血，混匀，分装及无菌检验同普通营养琼脂。

(2)特殊培养基：主要是麦康凯琼脂，制作方法为：取麦康凯琼脂粉55克，加入1 000毫升蒸馏水中，加热煮沸溶解、灭菌、分装及无菌检验同普通琼脂。用于肠道菌培养常用的培养基。

其他还有三糖铁琼脂、SS琼脂等。

2.细菌的培养：用于细菌分离培养和鉴定，病料的采集和运送参考本书第一章第三节。

(1)病料的处理：采集的病料，在接种培养前，应对其性状进行观察并做记录，如是否脓性带血或腐败，有何异味。

各种病料在分离培养前均应涂片，做革兰染色、镜检，以了解细菌的形态、染色特性，并大致估计其含菌量。通过肉眼观察和显微镜下看到的结果，对病料中可能含有的病原菌作出初步的估计。

如果病料是病变组织，又是用无菌方法采集的，在接种前一般无须作特别处理。但如果病料被杂菌污染严重，则需根据要分离的病原菌的特性，采用一些对病原菌无害但对杂菌有杀灭或抑制作用的方法，以抑制杂菌生长。如从粪便中分离沙门杆菌，可将粪样接种于亚硒酸钠肉汤中，作增菌处理。在这种培养基中，其他杂菌被抑制，而沙门杆菌则能自由繁殖。又如，分离布鲁杆菌、胎儿弯曲杆菌、炭疽杆菌、副结核杆菌可用选择性抗菌琼脂。分离链球菌和猪丹毒杆菌用叠氮钠结晶紫血琼脂等。如果从肠道内容物或从污染有不产生芽孢的杂菌培养物中分离能形成芽孢的细菌(如魏氏梭菌、破伤风梭菌等)，可将病料在80 ℃加热15分钟，以杀死不形成芽孢的杂菌，再接种培养基，即容易获得纯培养物。

有些病料(如乳汁、尿等)含菌太少，则应先做集菌处理，然后接种，以提高检出率，其集菌方法有离心法和过滤法。离心法取沉淀物作培养物;过滤法取沉积于滤板上表面的病料作培养。

(2)细菌的分离与接种：培养细菌时，须将标本或细菌培养物接种于培养基上，常用接种方法有如下几种：①平板划线接种法：本法为最常用的分离培养细菌的方法，通过平板划线后，可使细菌分散生长，形成单个菌落，有利于从含有多种细菌的标本中分离出目的菌，分离培养用的平板培养基应表面干燥，可于临用前置37 ℃孵育箱内30分钟，这样表面既干燥有利于分离培养，又使培养基预温，对培养某些较娇弱的细菌有利。常用的平板划线接种法有以下几种：a.分区划线法：此法多用于脓汁、粪便等含菌量较多的标本的分离。其方法是首先将接种环灭菌后，蘸取标本均匀涂布于平板培养基边缘一小部分(第一区)，将接种环火焰灭菌，待冷却后只通过第一区3～4次后连接划线(为第二区)，依次可划线3～5区，每一区细菌数可逐渐减少，直至分离出单个菌落为止。b.连续划线法：该法多用于含菌数量较少的标本。其方法是首先用白金耳将标本均匀涂布于平板培养基边缘一小部分，然后由此开始，在培养基表面自左向右连续划线并逐渐向下移动，直至下边缘。划线接种时，尽可能做到直、密、匀，有效地利用培养基表面达到充分分离的目的。如果标本含菌较多，接种在强选择培养基(如SS琼脂)上时或标本含菌较少时，采用分区划线法接种，接种环可一直划完各区，中间不必灭菌。②斜面接种法：采用该法目的是进行纯培养。其方法是从平板分离培养物上用接种环挑取单个菌落或者是取纯种，移种至斜面培养基上，先从斜面底部自下而上划一条直线，再从底部开始向上划曲线接种，尽可能密而匀，或者直接自下而上划曲线接种。③倾注培养法：此法适用于乳汁和尿液等液体标本的细菌计数。其方法是取原标本或经适当稀释(一般是10-1～10-5倍稀释)的标本1毫升，置于直径9厘米无菌平皿中，倾入已溶化并冷却至50 ℃左右的培养基约15毫升，立即混匀待凝固后倒置于37 ℃培养18～24小时，做菌落计数。

其他还有穿刺接种法和液体接种法等接种方法。

(3)细菌的培养方法：根据培养细菌的目的和培养物的特性，培养方法分为一般培养法、二氧化碳培养法和厌氧培养法3种。本书仅介绍一般培养法。将已接种过的培养基置37 ℃培养箱内18～24小时，需氧菌和兼性厌氧菌即可于培养基内生长。少数生长缓慢的细菌，需培养3～7天直至1个月才能生长。为便于培养箱内保持一定湿度，可在其内放置一杯水。培养时间较长的培养基，接种后应将试管口塞棉塞后用石蜡凡士林封固，以防培养基干裂。

3.细菌的鉴定：通过分离培养获得的病原菌，必须达到不含有其他微生物的纯培养程度，才能进行系统鉴定。系统鉴定就是通过病原菌的形态结构、生长特性、生理生化特性、抗原性和病原性大小等检测，并用已知标准免疫血清确定分离细菌的属、种和型。微生物鉴定的程序通常是根据其形态、生长、生化特性等定种，最后根据抗原的免疫血清学检测定型。

(1)形态学检查：各种细菌的形态，在适宜的环境下是相对稳定的。但环境的改变，如培养基条件的改变，抗生素和化学药品的作用等，均可使细菌产生不规则的形态，并可出现细胞壁的缺陷和多样性。为此，在做细菌形态鉴定时，必须按被检菌的生长要求，选择适宜的培养基和培养条件，以及适宜的培养时间和检查方法，才能做出正确的形态学鉴定。形态学检查一般包括两方面：肉眼观察和显微镜观察。①肉眼观察：肉眼观察主要观察细菌在固体、液体、半固体及鉴别培养基上的生产情况。在固体培养基上要观察菌落大小、形态、颜色是否均匀一致，表面是光滑湿润，还是干燥无光或呈皱纹状，边缘是否整齐，菌落是隆起、扁平，还是乳头样，是透明、半透明或不透明。在半固体培养基上应观察细菌是否沿着接种线生长，是呈刷样生长还是均匀生长，上下生长是否一致。在液体培养基中，要观察培养基是否呈均匀混浊，管底有无沉淀，液面有无菌膜，是否产气等。在鉴别培养基上，应观察其生长情况是否与预期的相一致。在血琼脂培养基上还要观察是否溶血及溶血圈的特点。在某些培养基上还要注意一些其他特性，如是否有臭味等。②显微镜观察：在做细菌个体形态学检查时，要根据被检菌的种类和检查项目，注意选择合适的培养基以及恰当的培养细菌的时间，并选用相应的染色方法，才能达到预期的目的。一般以18～24小时(生长时间长的细菌除外)的幼嫩培养菌为宜。例如，做革兰染色检查时，培养时间长的陈旧细菌，可能由阳性变为阴性。做细菌运动性检查时，液体培养基的幼嫩培养物(几小时到十几小时)最为适宜。做炭疽荚膜染色时，因炭疽杆菌在一般培养基上不形成荚膜，而在动物体内形成明显的荚膜，因此，应先接种小鼠，取死亡动物的病料作涂片标本镜检。作鞭毛染色时，以液体培养基为宜。芽孢的形成，因细菌种类不同，往往对培养条件如培养基、空气和培养时间等而异，但一般均要求较长时间。镜检时除注意其基本形态结构和大小(要用测微计测量)外，还应注意其排列状态、菌端形态、有无两极染色、有无形成芽孢和荚膜等。必要时可用电镜观察其微细结构。

(2)细菌的生化试验：细菌在人工培养条件下，在其生长繁殖过程中，不同菌种所产生的新陈代谢产物各异，表现出不同的生长特性。应用生物化学的方法来检测这些产物的性质，有助于对细菌的鉴别和鉴定。细菌的生化反应在种、型鉴别工作中具有重要价值，是继形态学鉴定之后的又一重要鉴别依据。

常用的生化试验方法有糖(醇)类分解试验、甲基红(M.R)试验、V-P试验、淀粉水解试验、吲哚(靛基质)试验、枸橼酸盐利用试验、硫化氢试验、凝固血清液化试验、硝酸盐还原试验、尿素酶试验、氧化酶试验、过氧化氢酶(触酶)试验、苯丙氨酸脱氨酶试验等。

(3)细菌血清型鉴定及血清学试验：血清型鉴定是微生物鉴定的特异方法。首先要求鉴定的细菌必须纯净，不能混有其他种细菌，而且要新鲜，细菌要在适当的条件下培养，尽量减少传代，以防发生变异，其次是要有特异性强和效价高的已知标准免疫血清(包括单克隆抗体)和标准菌株。有些种类细菌，如大肠杆菌和沙门菌不仅种、型繁多，而且抗原结构复杂，应购置专门的分型血清以备应用。最后是根据其菌体构造和抗原成分以及实验室的设备条件，选择相应的一种或几种血清学试验方法进行鉴定。

(4)细菌毒力测定：病原性细菌致病能力的强弱称为毒力。通常毒力越大，致病性就越强。同一种病原菌，因菌株不同，致病力大小也不相同，有强毒、弱毒和无毒株之分。用来表示微生物毒力大小的单位有最小致死量(M.L.D)或最小感染量(M.I.D)和半数致死量(LD50)或半数感染量(ID50)两种。

最小致死(感染)量是能使特定的动物感染后，在一定时限内发生死亡(感染)的最小的微生物量或毒素量。

半数致死(感染)量是在一定时限内使半数实验动物发生死亡(感染)所需的微生物或毒素量。试验时要选择年龄、大小、体重一致的动物，将动物分成若干组，每组动物数量相等。然后用等量的试验材料感染同一组动物。各组动物所用的试验材料量均有一定差数。对每组动物加以记录，然后用数学方法计算半数致死(感染)量。

(二)病毒的分离与鉴定

病毒分离与鉴定是病毒性疾病检疫、诊断和流行病学调查的重要方法之一，其主要目的是对患病的个体或群体进行科学的诊断，以便及时处理;对动物进行检疫，确定是否带有某种病毒病原;对病毒引起的疾病进行流行病学调查、追踪调查或者回顾性调查;对未知新病毒进行分类鉴定等理论研究。

1.病毒分离用样品的采集与保存参考本书第一章第三节。

2.病毒分离前样品的实验室处理方法：病毒含量较高的样品浸出液或体液，可不经过病毒分离直接用于诊断鉴定。病毒含量较少的样品，则需通过病毒的分离增殖来提高诊断的准确性和鉴定的可靠性。病毒分离首先要对样品进行适当的处理，然后接种实验动物或培养的组织细胞。

(1)组织器官样品的处理：用无菌操作取一小块样品，充分剪碎，置乳钵中加玻璃研磨或用组织捣碎机制成匀浆，随后加1～2毫升Hank's平衡盐溶液制成组织悬液，再加1～2毫升继续研磨，逐渐制成10%～20%的悬液;加入复合抗生素(注：Hank's平衡盐溶液和复合抗生素的配制见附);以8 000转/分离心15分钟，取上清液用于病毒分离。

(2)粪便样品的处理：加4克粪便于16毫升Hank's平衡盐溶液中制成20%的悬液;在密闭的容器中强烈振荡30分钟，如果可能则加入玻璃球;6 000转/分低温离心30分钟，取上清液再次重复离心;用450纳米的微孔滤膜过滤;加2倍浓度的复合抗生素。然后直接用于病毒分离或进行必要的浓缩后再行病毒分离。

(3)无菌的体液(腹水、骨髓液、脱纤血液、水疱液等)和鸡胚液样品：可不做处理，直接用于病毒分离。

(4)样品的特殊除菌处理：样品经过上述一般处理即可用于病毒分离，但对某些样品用一般方法难以去除的污染，则应考虑配合如下方法进行处理。①过滤除菌：可用陶土滤器、瓷滤器、石棉滤器或200纳米孔径的混合纤维素酯微孔滤膜等除菌，但对病毒有损失。②离心除菌：用低温高速离心机以18 000转/分(5.74厘米转子)离心20分钟，可沉淀除去细菌，而病毒(小于100纳米)保持在上清液中。必要时转移离心管重复离心一次。③乙醚除菌：对有些病毒(如肠道病毒、鼻病毒、呼肠孤病毒、腺病毒、痘病毒、小RNA病毒等对乙醚有抵抗力)可用冷乙醚对半加入样品悬液中充分振荡，置4 ℃过夜。取下层水相分离病毒。④染料普鲁黄(Proflavin)除菌：由于其对肠道病毒和鼻病毒很少或没有影响，常用作粪或喉头样品中细菌的光动力灭活剂。

(5)病毒分离样品脂类物质的去除：有些病毒样品(如组织样品)脂类和非病毒蛋白含量很高，必要时在浓缩病毒样品之前可用有机溶剂(如正丁醇、三氯乙烯、氟利昂等)抽提。方法是将预冷的等量有机溶剂加入样品中，强烈振荡后，1 000转/分离心5分钟，脂类和大量非病毒蛋白将保留在有机相中，病毒保留在水相中。应当注意的是，病毒必须对这些有机溶剂有抗性。

附：①Hank's平衡盐溶液+贮存液(HBSS，10×)的配制：

甲液成分：氯化钠80克，氯化钾4.0克，SO4·7H2O1.0克，Cl2·6H2O 1.0克，氯化钙1.4克，葡萄糖10克，双蒸水800毫升。

乙液成分：磷酸二氢钠1.15克，磷酸氢二钾0.2克，双蒸水200毫升。

制备方法：依照上列顺序称取各试剂，并依次溶解于水中。将甲液和乙液分别于121 ℃ 10分钟高压灭菌或过滤除菌。冷却后，将乙液缓慢加入甲液中，并持续搅拌。分装于100～500毫升灭菌瓶中，盖紧塞子，贮存于室温或4 ℃。使用时用灭菌双蒸水稀释，根据需要加入酚红指示剂(终浓度百万分之二十)、青霉素、链霉素，用碳酸氢钠调pH到所需值。

②抗生素的配制及使用浓度：抗生素的贮存浓度通常为使用浓度的100～200倍，特别是在细胞正常传代时尽量避免使用，或仅用100 国际单位/毫升青霉素、链霉素，其他抗生素是在做病毒分离、鉴定时，怀疑污染或已出现污染时才参考使用。