应用电子显微镜(电镜)(图)观察研究用样品的制备技术和方法。电镜是探索超微观世界， 尤其是观察和研究病毒形态结构及其与宿主细胞关系等不可缺少的工具;而满意的观察效果， 不但取决于电镜的分辨力，也取决于样品制备技术。不同类型的电镜有不同的制样方法。采用负染色技术可提高样品的反差和分辨力，获得病毒表面的立体结构; 采用超薄切片， 可从平面上了解病毒内部结构、形态、大小、复制方式和在宿主细胞内分布的位置; 采用X线衍射可将病毒形态结构与其化学组成有机地联系起来;超速离心技术的发展，可为电镜观察提供高纯度样品; 通过真空喷涂， 尤其是多角度和旋转投影技术， 为研究病毒的几何形态奠定了基础; 应用冷冻蚀刻技术， 不仅有助于分析病毒与细胞的关系以及病毒形态亚单位结构， 还能观察到近于生活状态的病毒形态; 通过扫描电镜技术， 可研究病毒表面及内部的立体构型;通过免疫电镜技术，可研究病毒抗原定位、毒株分型等。制样方法应依观察目的与要求而定。

电子显微镜

超薄切片(ultrathin section) 将离体或离开培养环境的动物组织或培养细胞样品，在一分钟之内，必须放入2.5～5.0%戊二醛固定液中，经四氧化锇(OsO4固定， 缓冲液冲洗， 然后用逐级浓度的乙醇或丙酮脱水， 环氧树脂浸透和包埋， 超薄切片， 以醋酸铀和硝酸铅双染色， 电镜观察。

负染色(negative stain ing) 利用重金属元素比生物材料中的轻元素散射电子能力强的原理， 将重金属盐 (常用磷钨酸) 溶液与病毒悬液混合， 重金属盐类即沉积在样品四周， 使样品周围有很强的散射电子的能力，在电镜照片上呈黑色， 样品本身则呈浅色，这样染色效果是在深色背景上呈现浅色样品， 故称负染色。其优点是： ①操作简单，用样少; ②制样快，只需几分钟， 可随做随观察;③能较好地保存生物结构;④样品反差强。常用方法有一滴法、两滴法和喷射法。

离子交换捕捉技术(ion-exchange capture techni-que) 一种纯化病毒技术， 常用于从粪便样品中纯化病毒。一般认为， 其原理是通过磷酸氢钙(CaHPO4)的静电引力将悬浮样品中的蛋白颗粒吸附， 再用溶解剂EDTA(乙二胺四乙酸二钠)将CaHPO4溶解， 使蛋白颗粒游离。其制备样品的纯度相当于超速离心。镜下观察， 图像背景清晰， 杂质少。适用于临床病料检测、快速诊断病毒病。

免疫电镜技术(immune electron microscopy)是研究抗原一抗体相互作用的一种方法。将免疫化学技术与电镜技术有机地结合起来， 使之兼有两方面特性。抗原一抗体反应具有较高的特异性， 电镜技术使得从超微结构或分子水平与研究免疫作用变成了现实。目前，常用的免疫电镜技术有： 未经标记的抗原-抗体相互作用的技术， 其中包括液相和固相免疫电镜技术;标记的抗原-抗体相互作用的免疫电镜技术，其中包括铁蛋白、过氧化物酶、胶体金标记等。

液相免疫电镜(liquid-phase immune electronmicroscopy) 即常规的抗原一抗体免疫复合物电镜法。抗原和相应的抗体特异性结合时， 形成大分子复合物或聚合物， 易沉淀， 便于电镜观察。此法最常用， 简便易行。但本法中应用的抗原与抗体要比例适宜。抗原或抗体过量或不足都不易形成便于观察的大块复合物。为此， 常用琼脂免疫扩散试验， 预先找出抗原一抗体合适比例，然后可用琼脂糖过滤法(琼脂糖板法)进一步浓缩和纯化样品， 较为简单实用。

固相免疫电镜技术(solid-phase immune elec-tron microscopy) 把抗体固定在固相载体上，在悬浮样品中捕捉相应的抗原(病毒粒子)， 便于在电镜下观察和鉴定。此法优点在于图像背景比较清晰， 无非特异性杂质，病毒粒子容易被发现。近年来，将金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)应用在此技术上，克服了抗血清(抗体)直接铺盖铜网膜的缺点，即使效价低的抗血清也会获得较满意的结果。常用方法有两种：①直接利用金黄色葡萄球菌作固相载体， 因为SPA具有吸附某些动物血清中IgG的特性(对猪IgG分子吸附最强，其次为人、豚鼠、小鼠、犬、猴、水貂等)。根据这一特性，可将金黄色葡萄球菌包被一层特异性抗体，在悬浮的样品中，它就像滚雪球似的，粘附着一层相应的抗原(病毒粒子)，即使含毒量低的样品，通过此法检查也较容易地找到病毒粒子;②利用铜网膜作为固相载体，通过SPA将特异性抗体固定在铜网膜上， 再通过抗体来捕捉抗原(病毒)。

免疫铁蛋白技术(immuno-ferritin thechniques)铁蛋白是一种含铁离子的蛋白质，具有电子散射力强的特性，并能与抗体稳定结合而不会使抗体失去免疫特性。样品多从马脾脏中提取。抗体与铁蛋白通过低分子量的双功能试剂结合，形成铁蛋白抗体。免疫铁蛋白技术一般分直接法和间接法。直接法是将处理好了的样品直接浸泡于标记了的抗体中，经充分浸洗后转入常规电镜固定和包埋程序： 间接法是将样品先与未标记的特异性抗体作用， 充分浸洗后再与标记了的抗抗体作用，其他步骤同直接法。铁蛋白标记技术的缺点是形成的铁蛋白—抗体复合物分子量太大(800 000以上)，难于穿入组织和细胞，仅适用于观察细胞表面抗原的定位。

放射自显影(radioautography) 利用放射性同位素发射的带电粒子(α或β粒子)作用于溴化银颗粒，使其感光产生潜影， 再经显影与定影得到“像”，以确定该放射性同位素在生物材料内径迹或定位。这一技术对核酸、蛋白质的合成和代谢研究， 多糖类和脂肪的合成及转移定位，检测分子杂交的结果，酶分子定位，用于标记抗体对抗原的定位，病毒感染细胞中的病毒复制合成过程的定位，追索在宿主细胞中病毒基因的踪迹，被病毒感染和未感染的细胞新陈代谢的比较等。其操作步骤如图。

核酸样品制备(preparation of nucleic acidsamples) 核酸分子样品制备主要应克服反差弱的困难和保持核酸分子在溶液中的构型，当克服上述困难后， 电镜观察即可区分各种核酸的单链和双链、环状和线状等不同形态，计算核酸分子长度和分子量，进而研究核酸的结构和功能。根据许多球蛋白均能在水溶液或盐溶液的表面上形成不溶的变性薄膜的原理，在适当条件下这一薄膜可以形成单分子层， 由伸展的肽链构成为一个分子网。再由蛋白质的氨基酸碱性侧链基因的作用，使核酸以三度空间的溶液构型吸附肽链网而转化为二度空间的构型，因而使核酸分子从形态到结构均能保持一定程度的完整性。同时应用了旋转投影法，不论核酸的长分子如何盘绕弯曲，在任何方向均可使其获得均一的投影而增加反差。在应用蛋白质单分子膜的基础上， 制样方法可分为展开法、扩散法和一步释放法。其中最常用的是展开法。展开法是把核酸加入到蛋白质溶液中，在后者展开成单分子膜时，核酸分子也同时分布于蛋白质基膜中间，并略受蛋白分子肽链的包裹。蛋白质核酸的溶液，一般称为展开溶液。表面承受蛋白质单分子膜展开的溶液称为下相溶液。核酸分子的完整性和分散性以及反差都和蛋白质单分子膜展开的好坏有关;而后者则又受展开液及下相溶液的多种因素影响。

冷冻复型(freeze replic) 也称冷冻断裂(freezefracture)或冷冻蚀刻(freeze etching)。主要操作步骤为： 冷冻、断裂、蚀刻、喷镀复型、分离、清洗复型膜、捞膜与电镜观察。其优点是避免常规固定可能造成的人工损伤，快速低温冷冻、保持生物结构，使之更能接近生活固有状态。用这种方法能够观察细胞膜、核膜和各种细胞器膜结构以及细菌、病毒等超微结构变化。

扫描电镜样品制备(preparation of scanningelectron microscopic samples) 除少数硬质样品如昆虫的甲壳和动物的毛、角爪、牙齿之类外，其他样品在观察之前都要进行处理。处理的难点是去掉样品中的水分。脱水十燥会引起形态变化，失去样品本来的面貌。为防止样品的体积变化和表面改变，通常采用的方法有：①为了减少脱水过程中的体积改变，用醛类和四氧化锇等进行固定;②用低表面张力的溶液脱水，如乙醇、丙酮等：③冷冻干燥，将新鲜的或固定的样品经液氮或其他冷冻剂快速冷冻，使样品中的水分在真空条件下升华达到干燥目的;④临界点干燥，利用物质临界状态时表面张力为零的特点，使样品在液化气的临界状态环境中得到干燥;⑤利用含水的新鲜样品在冰冻状态下直接作扫描电镜观察。