猪胚胎冷冻方法大体可分为三种，即慢速冷冻法(slow freezing)、玻璃化法(vitrification)和开口细管玻璃化冷冻法(vitrification ops)，现分别介绍如下：

慢速冷冻方法：由Whitingham等(1972)首次报道，他是最先使用的，也是用于牛、羊等冷冻保存中冷冻效果较好的方法，至今仍被世界各国广泛应用。此法采用以1.4mol/L的甘油为主体的抗冻保护液处理胚胎，目前略加改进用于猪胚胎冷冻保存。即胚胎首先在室温下在0.75mol/L甘油中预平衡5min，然后在-6.8℃左右进行强制结冰，使保护剂溶液迅速通过冰点，以防胚胎在长时间的冰晶形成过程中而损伤死亡。接着在降温仪的控制下，以-0.3℃/min的速度缓慢降至-35℃。在冷冻过程中，由于溶液渗透压的改变，胚胎内部自由水脱出而呈收缩状态后，即可将胚胎投入液氮中保存。对于不同的动物，解冻升温速度为4～25℃/min不等。解冻升温过程中水分重新渗透到细胞内部，使细胞得到恢复。此法比较安全，解冻后的胚胎发育率较高，在许多动物上被广泛应用，如牛(Wilmut和Rowso，1973;振源等，1983;Leibo，1984);家兔(Whittingham和Adams，1976);大鼠(Wittingham，1975);绵羊(Willadsen等，1976);山羊(Bilton和Moore，1976;Chemineal等，1986);马(Slade等，1985);猪(冯书堂等1990; Modl等1996)等动物胚胎的冷冻保存，移植后分别获得产仔。但是此方法植冰及冷却需要3h以上，且程序复杂，特别需要高精度温度控制仪。以上方法中大都采用甘油、DMSO为主的抗冻保护溶液，由于保护剂在常温下对胚胎有化学毒性作用(Dobrisky，1976)，所以解冻后必须立即除去。现普遍应用蔗糖溶液一步脱去保护剂，不仅节约了时间，而且提高了胚胎的发育率(Niemenn等，1982;Bielanski等，1986;阳年生等，1993)。

玻璃化冷冻方法：慢速冷冻方法虽然在冷冻胚胎的发育率及移植产仔方面得到了成功。但是需要用昂贵的降温仪控制且操作复杂，在生产过程中有一定的局限性。为解决这个问题，Rall等(1985)发明了玻璃化冷冻方法。这种方法采用7mol/L左右的极高溶度的抗冻保护剂，在0℃以上的温度条件下对胚胎进行急速脱水后，短时间内投入液氮。由于急速降温，抗冻保护液中的高分子物质易使保护液的液态变成非晶体化半固体玻璃化状态。这种状态下使细胞得到缓冲，因此在急速降温过程下不致造成机械损伤。玻璃化冷冻法操作简单、易行，无需购置降温仪器，在畜牧业生产中有着广泛的应用价值。但是，此法所用的甘油、DMSO和乙酰胺(AA)等为主的玻璃化溶液浓度高，化学毒性大，只能在较低温度下胚胎分步平衡后投入液氮。解冻后胚胎发育率不稳定(Hsu等，1986;河野角田，1987;Rall等，1987;Kono和Tsunoda，1988;Niemann，1991;yang等，1992)。当以丙三醇为主体玻璃化液对胚胎冷冻保存，解冻后的发育率绵羊为50%(刘云海等，1993)，牛桑葚胚为70%和81%(Douchi等，1990;柏学进等，1986)。另外，冷冻较困难的猪的扩张囊胚(Nagashima等，1989)，孵化囊胚(Kashiwazaki等，1991)也获得成功。为解决化学毒性问题，Kasai等(1990)筛选了低毒性的乙二醇(ethylene glycol：EG)为主体的细胞内液抗冻保护剂，附以聚蔗糖(ficoll，分子量70 000)和蔗糖(sucrose)为细胞外液抗冻保护剂配制成的玻璃化溶液(EFS液)，20℃室温下将小鼠桑葚胚在此液中平衡2～5min后投入液氮，小鼠桑葚胚解冻后的发育率为97%～98%;此后又应用家兔桑葚胚(Kasai等，1992)，小鼠扩张囊胚和孵化囊胚(Zhu等，1993，1996)，牛的体外受精囊胚(Tachikawa等，1993;Mahmoudzadeh等，1995)，解冻后的发育率分别为87%～100%、94%、97%、77%和98%。根据上述方法，Zhu等(1994)用丙三醇代替乙二醇制成GFS玻璃化溶液用以冷冻小鼠的扩张囊胚，发育率也达92%。上述各种动物的胚胎冷冻后移植均获得了较高的妊娠率和产仔率。

开口细管玻璃化冷冻法(ops)：此法是在玻璃化冷冻的基础上，由丹麦学者Vijta发明的一个更为快速的冷冻方法，用ops冷冻，每次冷冻体积只有2ml，而且由于冷冻液与液氮直接接触，并且细管拉薄了，所以冷冻降温和解冻升温的速度明显地比传统的细管玻璃化冷冻方法快得多。据测定采用ops冷冻，ops里的液体在-25℃和-175℃之间的降温度为22 500℃/min，在0～-195℃之间为16 700℃/min。而和用常规的0.25ml细管装4μl的冷冻液并封口作为对照，其降温速度分别为2 250和2 438℃/min，采用ops冷冻的降温速度要比常规法快近10倍。