1、前言
氟苯尼考（Florfenicol）是一种化学合成的酰胺醇类广谱抗菌药，最早于1979年上市，中国于1999年批准使用，用于治疗敏感菌引起的猪等动物的细菌性疾病（萧志梅，2000）。其作用机理是通过与细菌核糖体50s亚基结合，抑制细菌蛋白质的合成，起到抗菌作用。该药具有抗菌谱广、吸收良好、体内分布广泛，相对比较安全的特点，在养猪生产上，广泛用于防治大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、溶血性巴氏杆菌、各类链球菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、沙门氏菌等所致的多种细菌性疾病，尤其是在猪呼吸道疾病控制中（马建云，2005；许瑞，2011）。
副猪嗜血杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌是猪的两种重要的细菌性病原，尤其在猪呼吸道疾病的混合感染中起到重要作用。副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，HPS）由德国学者Glasser发现，于1910年首次报道，至少具有15个血清型，导致多发性浆膜炎，包括胸膜炎、腹膜炎、心包炎、关节炎和脑膜炎等。副猪嗜血杆菌病是规模化养猪场最常见的细菌性疾病（何启盖，2015），在猪群的分离比例仅次于链球菌，占比22.5%（郭龙等，2015）。胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae, APP）由Pattison于1957年首次报道，到目前为止已知有15个血清型，胸膜肺炎放线杆菌是生长育肥猪群的重要病原（何启盖，2015），常导致猪只猝死、胸膜肺炎和生长不良。由于HP和APP血清型众多，疫苗免疫常常面临交叉保护作用不强的问题，影响其防控作用，所以抗菌药物成为控制这两种病的主要手段，临床上，氟苯尼考是控制这两种疾病的最常用的抗菌药之一。
随着氟苯尼考在猪细菌性疾病，尤其是HPS和APP控制中的大量广泛使用，因此导致的细菌耐药性也逐年上升，使耐药菌株流行（Kucerova et al 2011, Vanni et al 2012）。其中国内已有报道重庆部分地区副猪嗜血杆菌对氟苯尼考的耐药率达到29%（魏光河和黄伟 2012），湖南部分地区的胸膜肺炎放线杆菌对氟苯尼考的耐药性也已达到20%（吴峙宏 2009），给疾病的治疗和控制带来了很大的挑战和威胁，寻找合理的联合用药已成为控制耐药菌感染和延长现有抗生素使用寿命亟待解决的问题。因此本研究筛选与氟苯尼考联合用药具有协同作用的抗生素，为APP和HP感染的治疗提供更多依据。
2 材料与方法
2.1 试验菌株
副猪嗜血杆菌SH0165株为血清5型的地方分离强毒株（严琦，2010），胸膜肺炎放线杆菌JL03株为血清3型的临床分离株（李良军，2008），均由华中农业大学农业微生物国家重点实验室动物传染病分室提供。两种细菌均在添加8%胎牛血清和5‰NAD的TSA固体培养基或TSB液体培养基中生长。
2.2 培养基及试剂
胰蛋白大豆琼脂(TSA)和胰蛋白大豆肉汤(TSB)购自英国OXOID公司；四季青无菌胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)购自美国Sigma公司，配制成1mg/ml的储存浓度，过滤除菌备用。
氟苯尼考：江苏恒盛药业有限公司生产，批号FB1503032；盐酸多西环素：扬州联博药业有限公司生产，批号YD141001100；硫酸粘杆菌素：山东鲁抗舍乐里药业有限公司生产，批号1411016；甲氧苄啶（TMP）：寿光富康制药有限公司生产，批号YR20140173。称取适量的以上四种抗生素，溶于相应量的溶剂中，使浓度为5120μg/mL，过滤除菌，-20℃保存。
2.3 体外MIC的测定
按照临床实验室标准化委员会（CLSI）(M100-S19)推荐的肉汤微量稀释法进行。将待测菌株分别接种液体培养基，37℃振荡培养至OD600≈1.0（相当108 CFU/ml），用液体培养基校正菌液浓度至0.5麦氏比浊管浓度，将菌液稀释到107 CFU/ml，备用；在96孔板中TSB培养基（含血清和NAD），在第一孔加入适当体积的抗生素储存液，后续孔进行2倍梯度倍比稀释；将之前稀释好的菌液加入微孔板中，使菌液终浓度达到105 CFU/ml，每孔总体积为100μl。同时做阴阳性对照，37℃培养APP 16-20h和HPS 48h，读取抗生素对菌株的最小抑菌浓度即为MIC，每次试验3个重复，重复三次。
2.4 联合用药的体外抑菌试验
用棋盘法测定氟苯尼考与多西环素、粘杆菌素和TMP联合的体外抑菌活性。将储存浓度的抗生素配制成2.5、5、10、20、40倍MIC的浓度，参照MIC测定的方法，分别将两种抗生素加入到同一个孔中，使各孔中的药物最终浓度分别为0.25、0.5、1、2、4倍MIC的浓度。另设阳性对照和阴性对照。重复棋盘试验3次，每次3个重复。氟苯尼考与其他抗菌剂的联合用药试验以抑菌浓度指数（Fractional inhibitory concentration，FIC）作为判断依据（曾令兵 1997, 吴亮等 2008）。FIC的计算公式为：
FIC = 甲药联合时的MIC/甲药单独时的MIC +乙药联合时的MIC/乙药单独时的MIC
当FIC≤0.75时判为协同作用，1.00≥FIC＞0.75时判为相加作用，2.00≥FIC＞1.00时判为无关作用，FIC＞2.00时判为拮抗作用。
3 结果
3.1 抗生素单用MIC的测定结果
氟苯尼考、多西环素、TMP和粘杆菌素单用对副猪嗜血杆菌SH0165株和胸膜肺炎放线杆菌JL03株的抑菌MIC较小，均≤1μg/mL，根据临床实验室标准化委员会（CLSI）的判定标准均为敏感。而副猪嗜血杆菌SH0165株对TMP的MIC为8μg/mL，属于耐药，详见表1。
3.2 抗生素联用MIC的测定结果
采用棋盘法对两种药物联合使用的体外最低抑菌浓度进行了测定，结果见表2和表3。其中氟苯尼考和多西环素联用后，对副猪嗜血杆菌SH0165株和胸膜肺炎放线杆菌JL03株的FIC=0.75，均呈现协同作用，而和TMP联用后呈现无关作用（FIC=1.5）。氟苯尼考和粘杆菌素联用对副猪嗜血杆菌SH0165株呈现无关作用（FIC=2），而对胸膜肺炎防线杆菌JLl03株却呈现协同作用（FIC=0.75）。
4 讨论
4.1 最近十余年，国内外学者对氟苯尼考开展了大量的体外抑菌试验，证实其对胸膜肺炎防线杆菌、猪链球菌高度敏感（马建云，焦库华，2005）。同时，经大量临床试验表明，氟苯尼考在治疗链球菌病和胸膜肺炎的效果也比较显著，在临床症状、肺病变计分、日增重、血清学试验等指标方面，效果优于其它抗菌药（席进华，杨金海，2005）。近年的研究发现，氟苯尼考对传染性胸膜肺炎的敏感性仍高于其它抗生素（de la Fuente，2007）。但随着抗菌剂的大量使用甚至滥用，细菌耐药性日益严重，目前在部分猪场使用氟苯尼考等常用抗菌剂对副猪嗜血杆菌和胸膜肺炎放线杆菌感染的治疗效果下降。因此，筛选具有协同作用或累加作用的抗生素组合，可以为临床确定合理的给药方案，不仅可以提高疗效和治愈率，还可以部分解决耐药菌株引起的感染，并且还可以防止耐药菌株的出现，延长抗生素的使用寿命，具有重要的理论和实践意义。
4.2 本研究采用临床控制呼吸道疾病的最主要的抗生素氟苯尼考与其他常用抗生素联合使用，测定FIC判断是否具有协同作用。经过联合用药测定和计算，氟苯尼考与多西环素联合使用对副猪嗜血杆菌和胸膜肺炎放线杆菌均具有很好的协同作用，与报道的氟苯尼考与多西环素联合使用对爱德华氏菌的抑菌效果呈现相加作用（陈福艳等 2010）和对猪源大肠杆菌的抑菌效果呈现协同或相加作用，缩小耐药突变选择窗（陈阳阳等 2013）等结果相一致；氟苯尼考与粘杆菌素联合使用对胸膜肺炎放线杆菌也同时具有协同作用，与文献报道对猪大肠杆菌和链球菌具有协同作用（康宇等 2008）的结果相似，而对副猪嗜血杆菌却呈现无关作用。因此这些结果提示在体内治疗由于副猪嗜血杆菌和胸膜肺炎放线杆菌引起的感染时，两药联用或可减少氟苯尼考的用量或者减少多西环素的用量，或提高疗效。
4.3 经试验测定，氟苯尼考和多西环素联合用药，对副猪嗜血杆菌和胸膜肺炎放线杆菌的抑菌配伍比例均为4:1，可呈协同作用。氟苯尼考和粘杆菌素联合用药，对胸膜肺炎放线杆菌的抑菌配伍比例为4:1，也具有协同作用。在临床上按照此比例进行合理组合用药，可以很大程度上节约抗生素的使用量或大大提高疗效，节约治疗费用和成本；或者在同样使用剂量和浓度下更为有效杀灭和抑制耐药菌的感染。这对氟苯尼考等的实际应用、抗生素的联合使用或者复方制剂的研制具有重要意义。
致谢：
本试验所用的副猪嗜血杆菌和胸膜肺炎放线杆菌为周锐教授提供，试验是在华中农业大学农业微生物国家重点实验室和兽医微生物与免疫实验室完成，因此一并表示感谢。
参考文献：
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